美國(guó)nightsea SFA DFP熒光濾光片的選擇指南

   由于GFP（綠色熒光蛋白）和其他綠色發(fā)光體（例如FITC）是使用廣泛的熒光染料，因此我們的寶藍(lán)色激發(fā)/發(fā)射裝置是體視鏡熒光適配器常用的選擇。在黃色Longpass和綠色bandpass屏障濾波器選項(xiàng)之間進(jìn)行選擇時(shí)，經(jīng)常會(huì)要求我們提供建議。本文將介紹每種方法的優(yōu)缺點(diǎn)。

光譜特性

• Longpass –傳輸所有大于500nm的波長(zhǎng)
• bandpass –僅在500 – 560nm之間傳輸

實(shí)際上，這意味著bandpass僅傳輸綠色波長(zhǎng)，而Longpass則傳輸綠色，黃色，橙色和紅色。

濾光片作用

     熒光應(yīng)用中任何濾光片的目的都是為了增加您想要看到的東西（“信號(hào)”）的觀看對(duì)比度。主要工作是阻擋來(lái)自激發(fā)源的反射光并透射熒光發(fā)射。其他潛在的干擾源（“噪聲”）是觀看區(qū)域中其他物質(zhì)的熒光，這些物質(zhì)可以掩蓋目的信號(hào)。這可能是來(lái)自諸如生長(zhǎng)培養(yǎng)基（與秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)一起使用時(shí)）或?qū)ο蟊旧淼囊徊糠郑ɡ缰参镏械娜~綠素或發(fā)育中的斑馬魚(yú)卵黃）之類(lèi)的背景熒光。

Longpass濾光片和bandpass濾光片都可以很好地阻擋激發(fā)光。

盡管您可能會(huì)認(rèn)為選擇與預(yù)期釋放量緊密匹配的濾光片會(huì)更好，但這并非總是如此。

    如果您要消除的噪聲與信號(hào)沒(méi)有重疊，則bandpass是一個(gè)不錯(cuò)的選擇。例如，在擬南芥或其他植物中，葉綠素發(fā)出的紅色熒光就是這種情況，如下圖所示*。葉綠素發(fā)出遠(yuǎn)紅色的光，其峰值在約685 nm處。在使用Longpass濾光片制作的左側(cè)圖像中，紅色熒光難以區(qū)分綠色GFP熒光。綠色的bandpass濾光片消除了這種情況，使您很容易看到葉子中的GFP熒光。

      如果噪聲與信號(hào)頻譜重疊，則bandpass濾波器可能會(huì)引起混淆。使用Longpass濾波器，您可以通過(guò)兩種潛在的方式將信號(hào)與噪聲區(qū)分開(kāi)：強(qiáng)度和 顏色。使用bandpass濾鏡，您可以刪除顏色（光譜），而僅保留強(qiáng)度。下面的熒光轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)圖像說(shuō)明了這一點(diǎn)。這條魚(yú)**在心臟中表達(dá)GFP，在血細(xì)胞中表達(dá)mCherry。下圖是兩幅圖像的合成-一幅是使用Longpass濾波器拍攝的，另一幅是使用綠色bandpass濾波器拍攝的。

通過(guò)Longpass（頂部）和bandpass濾光片拍攝的轉(zhuǎn)基因熒光斑馬魚(yú)

     在頂部圖像中，您可以看到綠色熒光的心臟，紅色熒光的血細(xì)胞和蛋黃的天然黃色熒光。這些很容易區(qū)分。在下部圖像中，所有內(nèi)容均以不同的綠色強(qiáng)度顯示。心臟明亮，但蛋黃沒(méi)有那么暗。說(shuō)所有綠色都與GFP表達(dá)有關(guān)是不正確的。在這種情況下，*好使用Longpass濾鏡觀看物體。

      在某些情況下，選擇不太明顯。秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基具有一些背景綠色熒光。與黃色長(zhǎng)通相比，綠色bandpass濾鏡確實(shí)增加了一些清晰度和對(duì)比度。在許多測(cè)試中，我們讓數(shù)名觀察員觀察了相同的樣本。有些人喜歡長(zhǎng)通，因?yàn)樗麄冋J(rèn)為這實(shí)際上有助于查看背景的某些背景，而另一些人則喜歡同一樣品的帶通。在這種情況下，很可能還有其他選擇，選擇并不*明顯，可能取決于個(gè)人喜好。

如果您正在自然探索熒光？長(zhǎng)傳肯定是要走的路。您無(wú)法使用帶通濾鏡捕獲此草花的圖像。

* 擬南芥  由波士頓大學(xué)的John Celenza博士提供。

**斑馬魚(yú)由Martha Marvin博士（威廉姆斯學(xué)院）提供，這是由Lara Hutson博士（布法羅大學(xué)）培育的轉(zhuǎn)基因品系。